prm-PASEF

文摘

标准的选择与平行反应监测(SRM和人口、难民和移民事务局),prm-PASEF增加肽的数量可以针对一个采集方法,在不影响选择性和灵敏度。使用原型采集软件,我们针对201 isotope-labeled合成肽(AQUA肽)飙升到100 ng人类海拉细胞消化。17的prm-PASEF超越极限的量化,阿莫勒2对一些肽利用收购方法可以监视216前体30分钟LC梯度。注射之间的新的prm-PASEF方法重现性高,使精确的量化。

作者

安东尼Lesur¹,Pierre-Olivier Schmit²,克里斯托弗•亚当斯³,贡纳·迪特玛¹;
1 LIH Strassen、卢森堡;2力量法国S.A. Wissembourg、法国;美国圣何塞3力量Daltonics公司

关键词:

4 d-proteomics prm-PASEF timsTOF Pro, PASEF LFQ,绝对定量,目标蛋白质组学

有针对性的质谱分析是一项功能强大的技术支持假说驱动的蛋白质组学实验中,例如,在大样本人群验证生物标志物的候选人。减轻之间缺失值样本的问题但也增加了整体的敏感性而视(DDA)和data-independent (DIA)收购的方法。目标蛋白质组学使用合成肽作为内部标准规范化的信号和女士证实了检测内源性肽以最大的信心。

有针对性的蛋白质组学的主要限制是妥协之间必须找到目标测量在一个运行的数量,液相色谱分离的持续时间,总体敏感性。这仍然适用与当前一代的有针对性的获取方法包括SRM和人口、难民和移民事务局。因此,只有可能实现完整的数据完整性为大量目标肽通过采用更长的色谱分离或妥协的灵敏度和选择性。DIA等其他方法可以部分解决这个问题,依赖于系统co-isolation和合作*碎片洗脱肽的使用广泛的m / z隔离窗口。这种方法措施大部分的肽,但有限的特异性和灵敏度(所有碎片混合在一起)在实现周期女士(扫描速度分析仪必须最小化),并且不容易结合短色谱梯度。

在这个应用程序中,我们提出prm-PASEF方法,一个创新的实现PASEF收购策略,克服了约束与当前目标有关蛋白质组学技术。

人类细胞系消化(100 ng /µL)飙升了201重aqua肽和15光合成肽如图1中所描述的。浓度稀释曲线9点从5.5到50000阿莫勒/µl使用15个沉重的水生成肽及其光。这组肽作为内部标准。其他186个AQUA肽是恒定浓度的上升2 fmol /µl在所有样本。

样品和控制注射技术一式三份和分离纳米高效液相色谱(nanoElute,力量Daltonics)使用250毫米把发射器列(IonOpticks、澳大利亚),30分钟梯度加强梯度从2 - 30%乙腈。肽分析timsTOF Pro质谱仪(力量Daltonics)在人口、难民和移民事务局- PASEF操作模式。单个prm-PASEF方法被用于这项研究:蒂姆积累时间固定50毫秒,而蒂姆分离时间被设置为100 ms。移动的范围是0.65 -1.3 1 / K值₀和m / z覆盖范围是100 - 1700 m / z。数据处理Skyline-daily (20.1.1.83)。

量化性能评估测量15重/轻比例在每个浓度水平,通过确定各自的浓度准确性和相对标准偏差。质量控制,两条曲线的浓度是back-calculated第一条曲线的线性回归。量化的极限(定量限)被定义为最低浓度在80% <精度< 120%与信号高于均值(空白)+ 3×SD(空白)。

多路复用的性能是评价通过测量的区域prm-PASEF痕迹为186年沉重的AQUA肽以恒定浓度上升。相对标准偏差(RSD)地区和整个色谱峰数据点的数量(使用最高的人口、难民和移民事务局过渡)30 prm-PASEF运行计算。

prm-PASEF利用困的离子迁移谱法(蒂姆)设备急剧增加的多路复用能力的方法。这使得大规模并行化的目标收购没有不利影响的敏感性和更大的灵活性,实现快速LC和UHPLC。蒂姆斯细胞的捕获和洗脱原理(图2)允许所有目标肽,离子迁移顺序洗提的维度,收购在100年 蒂姆斯女士扫描事件。此外,聚焦效应增加了敏感性因为肽积累100年 女士然后筛选了5 山峰女士的女士。

216年前体的洗脱时间30分钟梯度分布在22分钟。prm-PASEF acquisitionwindows是三维的,必须定义一个隔离窗口根据色谱洗脱时间,离子迁移率和四极隔离m / z。我们将保留窗口设置为40 s /前体,它生成的大量重叠LC保留时间维度。然而,IMS维度降低最终收购窗口重叠,如图5所示。前体离子与重叠收购窗口,仍然可以被分离的离子迁移率测量维度在同一个prm-PASEF框架(图3)。

prm-PASEF的绝对定量潜力评估通过研究重/光比15停在肽对。选择性和灵敏度的组合允许信号检测,即使在低浓度的详细分析(图7)。ATVVYQGER重/轻对显示信号的响应可以通过线性回归拟合在一个浓度2900倍(从17.2到50000注射阿莫勒列)。此外,浓度的反演计算的两个一式三份,校准曲线的基础上建立的第一个,可以确定证实定量精度±20%浓度(表1)。量化的极限(定量限)被定义为最低浓度在80% <精度< 120%与信号高于均值(空白)+ 3 x SD(空白)。

在这个实验中,平均4目标离子测量在每个prm-PASEF框架(图5 b)而不影响敏感性和周期时间。当几个化合物重叠在IMS和LC维度,他们以连续PASEF帧(图4)。平均而言,有4个不同的在prm-PASEF prm-PASEF帧周期。在最高前体密度,使用10帧/女士周期(图5)。帧的数量每周期女士不会影响灵敏度,但数据点的数量定义色谱峰。尽管如此,没有under-sampling色谱峰(图5 d),每个色谱峰的数据点数中值为25岁,这表明实验可以执行与一个更短的梯度。好峰值采样和保存灵敏度允许测量正确RSD为所有峰值区域,即使没有内部标准归一化(图6)。