神经科学研究

人脑中的化学突触很小。

由于突触的大小和分子密度等特性，神经科学研究人员感兴趣的突触和其雷竞技怎么下载他结构很难通过常规的微观研究方法进行研究。然而，在分子水平上提取有关这些结构的空间组织、化学计量学、相互作用和动力学的信息是必不可少的;雷竞技怎么下载增进我们对人脑的了解取决于开发更多更好的方法。

理想的神经科学显微镜方法不仅应该比传统方法获得更高的分辨率，而且还应该区分特定的结构，并为多种样品类型提供完整可靠的信息。

在提供这些功能的同时，具有单分子定位的超分辨率显微镜(SMLM)克服了传统神经科学显微镜的许多局限性。这已经极大地提高了我们对神经元和大脑功能的理解，并将继续为该领域的研究和发现创造新的机会。

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神经科学研究人员在选择成像方法时面临着一个独特的挑战:从历史上看，没有一种方法能够在分子水平上提供关于神经元结构和过程的完整信息，因此选择一种方法需要在能力之间妥协或通过多种方法进行补充调查。雷竞技怎么下载

例如，许多感兴趣的结构几乎不可见或无法通过能够特定标记的方法发现，如衍射限制双光子显微镜。然而，电子显微镜提供了更高的分辨率，并且是唯一能够可视化小于50nm的感兴趣结构的方法，如突触间隙和突触囊泡，但缺乏荧光显微镜容易标记特定结构的蛋白质的能力。^1，2这限制了研究人员进行复杂研究的机会，包括蛋白质鉴定或神经元追踪。

超分辨率SMLM有何不同?

与传统的神经科学显微镜方法相比，超分辨率显微镜既能实现目标特异性荧光标记，又能实现远低于光学显微镜衍射极限的分辨率。因此，它可以提供对结构和过程的独特且通常难以访问的见解。

在神经科学研究中使用的各种超分辨率成像技术中——包括结构照明显微镜(SIM)、受刺激发射-消耗(STED)和膨胀显微镜——SMLM是唯一完全依赖于分子成像分析的方法。SMLM还提供最高分辨率．^3.因此，SMLM具有20 nm的横向分辨率和特定的荧光标记，是促进神经科学发展的精致工具．

SMLM在神经科学研究中用于什么?

由于其在标记特异性和分辨率方面的优势，SMLM具有高度适用于神经科学研究人员感兴趣的许多问题的潜力，并且SMLM技术已经在广泛的神经科学应用中使用。

到目前为止，这些研究的结果已经证明了该方法对组织和培养样本的结构和定量分析以及3D成像的适用性。^3.在这些应用中，SMLM已经能够深入了解广泛结构和过程的空间组织、化学计量学和时间动力学，并提供了比其他方法研究分子相互作用(分子大小、密度、距离、重叠等)的显著优势。雷竞技怎么下载

SMLM对神经科学研究有局限性吗?

在组织样本上进行的SMLM研究在SMLM文献中出现的频率低于在培养细胞上进行的研究。这种不平衡在要求在组织中进行3D成像的应用中尤其明显，并且可以归结为研究人员感到沮丧的几个来源。这些包括:

1. 与培养细胞相比，组织样本的制备更加复杂和耗时
2. 组织样本显示荧光分子发出的背景信号越来越具有破坏性^3.(需要更先进的分析工具来处理)

因此，SMLM技术可达到的成像深度可以为处理组织切片和厚样本带来挑战

^{*一些仪器达到了优越的成像深度，特别是组织样本的3D成像
(参见“Bruker的Vutara VXL在神经科学应用中的优势更多信息)。}

SMLM适用于神经元结构和过程的研究，包括(以及其他):

• 神经系统发育
• 神经电路组件
• 突触的形成
• 突触传递
• 突触蛋白

关于神经科学应用SMLM你需要知道什么

根据所使用的设备、样品和荧光团的不同，SMLM方法具有实现高横向定位精度和~20 nm空间分辨率的潜力。然而，当对培养样本和组织切片成像时，实际分辨率和定位精度取决于各种其他因素。其中包括，标记密度和精度，信号大小和强度，以及显微镜漂移。通过优化SMLM的样品制备方法，例如，增加标记抗体浓度，可以解决许多这些问题，并为成功分析扫清道路。

为什么工具选择和技术一样重要

SMLM成像系统本身的组件和功能会限制任何一种SMLM技术所能达到的分辨率和定位精度特别是在对组织切片进行3D成像时．此外，能够使用smlm的显微镜需要耗时的设置，这分散了关键研究过程的注意力。它们还经常与落后于成像能力的分析工具配对。

理想的SMLM-Capable神经科学显微镜特征

鉴于仪器配置可能会任意限制SMLM调查的可实现结果，因此选择与您的特定研究目标相一致的已知功能的设备非常重要。通常被认为提供了最大的成功机会，并使研究人员能够充分利用SMLM在神经科学应用中的好处，包括:

1. 密集而特异的荧光标记
2. 多路复用功能
3. 增强成像深度
4. 先进的分析支持

Bruker’s Vutara VXL SMLM显微镜在神经科学研究中的优势:

力量的Vutara VXL提供一流的易用性和成像深度，支持广泛的不同实验需求。主要特点包括:

• 自动化的工作流程:
  SRX软件可以很容易地获得必要的数据集。工作流程允许用户专注于生物学问题，而不是修补复杂的显微镜设置。
• 卓越的3D成像和样本灵活性:
  专有的双平面检测提供三维信息，并能够在组织切片内成像。
• 无限多路复用能力:
  集成的微流体装置允许连续标记无限数量的荧光探针。
• 专家应用程序支持:
  Vutara VXL用户可以收到针对其研究目标的样本制备优化的个性化指导。

所有的SMLM方法都依赖于荧光分子的选择性开关。经典STORM使用染料对(例如Cy3-Cy5)，而dSTORM⁶(直接STORM)只需要一个荧光团(例如Alexa647, Cy5)和一个“开关缓冲区”。然而，在STORM和dSTORM中，不同波长的照明会开启和关闭这些荧光染料。

STORM的优势⁷与PALM相比，这些染料分子具有高效的大光子预算，其中PALM中使用的光激活蛋白发射出有限数量的光子，不可逆光漂白。因此，STORM可以实现更高的分辨率。

^{该技术的示例应用}

• 用纳米分辨率绘制大脑中突触蛋白的三维分子分布雷竞技怎么下载⁴
• 揭示了轴突和树突中肌动蛋白和光谱蛋白的组织原理⁵

与STORM类似，PALM使用光激活荧光蛋白(例如paGFP, mEOS2)，这比光开关染料更容易标记。这些蛋白质用一种激光波长打开，然后成像，然后用另一种激光波长漂白。

PALM和STORM之间的主要区别——PALM的优势在于它允许在内源性水平上标记蛋白质。此外，由于其他SMLM技术为每个分子提供了许多定位事件，PALM为每个分子提供了单个定位事件，通常更适用于与化学计量学/真分子计数相雷竞技贴吧关的实验目标。雷竞技怎么下载

^{该技术的示例应用}

• 探索突触后支架蛋白如何在25 nm分辨率下聚集在活性上⁸

其他SMLM技术需要对目标生物结构进行顺序染色，并对其反复成像以产生合成图像。在PAINT方法中，荧光团不再永久地结合在目标上，而是漂浮在缓冲溶液中。而不是激光，过渡绑定和固定标签(如尼罗红)从缓冲液到所研究的结构提供开关机制。这允许在同一样品中成像无限数量的感兴趣的结构，并使PAINT方法比其他SMLM方法更容易和更有效地实现。

而光漂白减少了用于其他SMLM技术中标记结构的发色团的光子预算，PAINT¹⁰方法对光漂白免疫。因此，PAINT方法可以实现比其他技术更高的空间分辨率。

^{该技术的示例应用}

• 突触蛋白的精确共定位研究⁹