高通量蛋白质组学通过大规模样本集推进临床研究

牛津大学靶点发现研究所(TDI)的研究重点是将遗传学、基因组学、细胞和化学生物学的最新进展联系起来，以解决精确定义药物靶点以加速药物开发的需求。

在TDI内，发现蛋白质组学设施为来自牛津大学的研究人员以及国内和国际合作者提供实验设计、样品制备和样品分析指导。在他们的成就中，该团队开发了样品制备技术，使用Bruker timsTOF Pro等仪器从少量样品中访问深层蛋白质组。Roman Fischer教授于2009年加入牛津大学，并于2016年成为探索蛋白质组学设施的负责人。在此期间，他见证了临床蛋白质组学的发展，以及用于蛋白质组在组织和肿瘤等生物结构中的空间表征的应用。他的工作包括开发高通量临床队列样本蛋白质组特征的方法。

在过去的二十年里，技术和新方法的重大进步使蛋白质组学成为蛋白质科学家、生物学家和临床研究人员的一个极其强大的工具。人类疾病分子原理的发现是寻找人类疾雷竞技怎么下载病新疗法的动力。质谱(MS)可以帮助研究人员发现复杂疾病过程中的关键“分子窗口”。雷竞技怎么下载质谱技术的不断发展使研究人员能够开始可视化一个细胞或有机体的蛋白质组(在特定时间表达的一组蛋白质)，目标是全面识别所有蛋白质及其相关的生物活性。

临床蛋白质组学将蛋白质组学应用于患者护理，但对患者蛋白质组学数据的分析需要特殊的策略。挑战包括如何从具有高度个体变异性的数据中提取有意义的蛋白质表达签名，如何将患者的基因组背景整合到蛋白质组学数据的分析中，以及如何确定生物标志物并正确估计其预测能力。

在TDI内，Roman Fischer和他的六名科学家团队在Discovery蛋白质组学设施工作，研究蛋白质功能、动力学、翻译后修饰(PTMs)及其对蛋白质周转、抗原递呈和代谢途径的影响。该小组专注于蛋白质组学、MS和生物化学方法来了解疾病过程。使用综合方法的分析能力的扩展导致了对人类疾病分子过程的更全面的了解。雷竞技怎么下载Fischer教授解释道:

“牛津大学是临床生物医学研究的好地方。我们有多家医院和非常强大的生物医学研究。我们的研究所与医院紧密相连，我们有许多合作，蛋白质组学已成为主要研究战略的一部分。因此，这意味着临床研究人员对包括蛋白质组学分析在内的样本的需求越来越大。

与此同时，每项临床研究的平均样本数急剧上升。这就是高通量蛋白质组学在正确的时刻出现的原因。”

当Fischer教授开始在牛津大学工作时，蛋白质组学并不是临床项目的驱动力，因为样本集通常非常小。此外，由于当时质谱仪的速度、灵敏度和分辨率有限，很难实现对完整蛋白质组的覆盖。临床样本通常具有挑战性，具有极端数量的蛋白质和高动态范围[2]。这为质谱分析带来了并发症，因为质谱的动态范围往往比临床样品[3]中蛋白质的动态范围小得多。费舍尔教授描述了早期的情况:

“当时，在临床蛋白质组学中，你很难分析血液样本。由于蛋白质丰度的高动态范围，这些样品通常很难用蛋白质组学进行分析。一些样本类型是“棘手的”，因为它们将包含与ms不真正兼容的成分。在这一点上，使用蛋白质组学运行大量样本是不容易或不可能的。当时，一批200个样本对于蛋白质组学研究来说已经很多了。如果你每天只能分析10个样本，那么计算200个样本需要多长时间就很容易了。此外，蛋白质组学实验室有多个项目并行运行，仪器时间非常宝贵。所以，当时我们实验室需要专门一台机器运行两到三周进行数据采集，这是一个很大的挑战。在过去，高通量蛋白质组学一直是通过在实验室中增加质谱仪的数量，以低通量分析大量样本来解决的。”

Discovery protein omics Facility的研究人员发现，Bruker timsTOF Pro显著提高了临床研究中实现高通量蛋白质组学的能力。timsTOF Pro最大的优点之一是分析的速度。Fischer教授描述了他的团队使用该设施的临床样本对timTOF Pro进行的初步测试:

“我们开始寻找一种仪器或平台，可以处理血液来源的非常困难的临床样本。因此，我们创建了200个示例用于演示，以了解不同的供应商如何处理这类请求。我们把这个演示做得相对困难，因为我们有很多样本，我们需要在两天内分析它们。

所以，我们想要的是每天100个样品的吞吐量。Bruker向我们提供了出色的数据，并且不担心仪器的稳健性。”

timsTOF Pro使用俘获离子迁移率光谱(TIMS)，其中离子被气流推动通过TIMS隧道。电场控制每个离子移动到由离子的流动性定义的位置之外，在那里它从气流中经历的推力与电场的力相匹配。降低电场可以根据离子的迁移率选择性地从TIMS隧道中释放离子。

这个过程被称为并行积累-串行分段，简称PASEF。独特的TIMS设计使研究人员能够重复测量所有检测到的离子的碰撞截面(CCS)值，这些值可用于进一步提高系统的选择性，使复杂样品和短梯度分析的相对定量信息越来越可靠[4]。新颖的PASEF设计允许离子在前面部分积聚，而后面部分的离子根据其离子迁移率依次释放。

Discovery protein omics Facility研究团队发现，Bruker timsTOF Pro具有独特的特性，可以常规测量离子迁移率信息，并在保留时间、m/z和离子迁移率(1/K0)和MS1强度方面实现高质量的4D特征比对(图1)。比对将定量血浆蛋白的数量提高到在单个11.5分钟LC-MS/MS运行中超过500个蛋白，如果将所有运行结合起来，则可以共定量772个蛋白(图2)。实现这种深度提供了全新的可能性，可以分析数百到数千个样本的大样本队列，以发现血浆中的生物标志物。

PASEF技术可以在不损失灵敏度或分辨率的情况下实现>100 Hz的测序速度。这是通过同步四极隔离质量窗口与特定肽包从TIMS隧道的洗脱时间来实现的。对低丰度多肽进行多次筛选，可提高其质谱质量。在小于200ng的样品负载下可以获得优异的结果，因此降低了样品制备成本和MS维护频率。利用90分钟的梯度长度，可以从一个典型的人类细胞系裂解液中鉴定出5400多个蛋白质组。

健壮性是timsTOF Pro对Discovery蛋白质组学设施团队的另一个主要优势。许多用于鸟枪蛋白质组学的质谱仪器需要每两周或每月清洗一次，当对大样本队列每天运行24小时时，即使在更短的时间内，性能也会明显下降。Fischer教授描述了这种能力对蛋白质组学研究的影响:

“即使在注入大量样品后，timsTOF Pro内部仍保持非常干净。通常情况下，一台仪器在采集了200个血液样本后就需要清洗。在高通量环境下，这意味着我们需要每两天清洗一次仪器，这包括为仪器通风和拆卸内部进行清洗。需要两到三天的手术才能恢复正常，这对于每天100个血液样本来说是不可行的。timsTOF Pro真的改变了我们因为乐器的构造方式。离子源长时间保持清洁。

我们在timsTOF Pro仪器上运行的最大一批样品是4500针未耗尽的血液，这是你能扔给它的最具挑战性的样品之一。

在这批货之后的预防性维护服务中，工程师说机器内部就像新的一样。就如何运行这些样本而言，它改变了我们的游戏。”

timsTOF Pro还可以从少量高度复杂的混合物中提供可重复的定量信息。Fischer教授解释道:

“Bruker timsTOF Pro可以达到100+ Hz，这意味着它有可能每秒识别100或更多的肽。

与其他仪器相比，我们真的可以缩短梯度时间，即使是像总细胞裂解物这样的样本，也不会影响我们得到的数据的深度。另外，这仪器也很灵敏。因此，我们不会为了提高速度和健壮性而牺牲灵敏度。这通常不是任何实验室仪器的情况-总是有一个权衡。但不是用timsTOF Pro。”

随着临床蛋白质组学的发展，费舍尔教授和他的团队发现，项目中纳入的样本数量大幅增加，仅在过去两年里就翻了一番。这使得研究人员能够纳入更多的条件和更好的控制，以及时间过程，而不是单一的时间点。Fischer教授解释了原因:

“蛋白质组学现在更容易获得。有软件可以相对容易地分析数据，你可以很好地可视化它。随着越来越多的人将蛋白质组学应用到他们的项目中，对蛋白质组学的需求大幅上升，这与临床研究中经常应用的其他组学学科(如基因组学或经典生物化学方法)是互补的。”

其中一项研究涉及肿瘤研究，费舍尔教授和他的团队使用蛋白质组学来确定肿瘤在空间环境下的功能。他解释说:

“这是非常及时的，因为现在我们可以将蛋白质组学与激光捕获显微解剖(LMD)等其他技术结合起来。这是一个非常有趣的方法，因为它允许我们维持蛋白质组的空间环境。

目前，我们仍在试图理解像肿瘤或器官这样的大型结构中空间分辨的分子相互作用。雷竞技怎么下载例如，我们在肿瘤的血管周围看到炎症标记物，但在其他地方看不到，所以我们试图了解这些肿瘤在分子水平上发生了什么。雷竞技怎么下载这将影响哪些蛋白质是靶向的，以及药物如何被运送到它们最有效的位置。通过结合MS和LMD，我们可以重新定义表型。从本质上讲，蛋白质组成为细胞表型的一部分，因为它现在可以用空间分辨率观察到。我喜欢称之为“表型蛋白质组”。显然，这种方法也可以以空间对应的方式与基因组或其他组学分析相结合。”

发现蛋白质组学设施的研究人员发现，Bruker timsTOF Pro的功能特别有价值的最新项目之一是一项研究，旨在对COVID-19感染[6]中的宿主免疫反应进行深度表型分析。

COVID-19多组学血液图谱(COMBAT)联盟是牛津大学一个大型多部门合作项目的一部分，该项目正在描述对SARS-CoV-2感染的免疫反应。具体而言，COMBAT旨在对SARS-CoV-2感染的外周血反应进行深度表型分析，以了解为什么一些COVID-19患者会发展为严重疾病，目的是早期发现这类患者并有针对性地进行治疗。为了做到这一点，牛津大学不同实验室正在使用广泛的分子技术(多组学和免疫学)，从不同感染时间点采集的核心患者样本中生成大规模数据集。雷竞技怎么下载该项目分析了大约500个样本，并观察了与疾病严重程度相关的蛋白质。Fischer教授解释道:

“我们已经非常清楚地了解到，在临床的那个时间点，与患者病情相关的蛋白质数量相对较少。这些蛋白质将清楚地指向体内的急性期反应。从这个角度来看，许多现有的药物可以解决这种急性反应。因此，在这种情况下，我们可以通过对潜在生物学的深入了解来支持这些发现。”

这项研究涉及200-300名患者，其中一些患者在多个时间点采集了样本，并在Bruker timsTOF Pro上使用高通量蛋白质组学进行分析。这项研究采用了一种新的方法，通过使用这些样本的亚组来与其他组学技术进行分析，例如对某些血细胞进行现场分析。血浆蛋白质组使亚表型进入患者群体，这是严重程度和结局的预测(图3和4)[6]。Fischer教授解释道:

“由于一些技术的高通量能力较差，我们在蛋白质组学方面处于一个新的位置。通常情况下，是反过来的你会对整个样本集使用基因组学的方法，然后你会用蛋白质组学进一步分析一个子集。这个项目是第一次颠倒过来，这样我们就可以用蛋白质组学来覆盖整个样本集，其他技术将被用来覆盖一个亚组。

在我们对同一组样本进行的这项大型研究中使用的8种组学中，蛋白质组学最适合将COVID-19患者分为不同的疾病严重程度组，而其他技术提供的数据有助于了解潜在的生物学。

此外，我们可以确定指标或标记，帮助我们了解疾病的进展，甚至可以预测结果，最终目标是为这些患者进行干预和量身定制的治疗。”

该蛋白质组学分析确定了特定的血浆急性期蛋白水平作为严重疾病的指标，并有证据表明急性期炎症、补体激活/攻击、纤维蛋白凝块、蛋白酶、血清淀粉样蛋白、组织坏死、受体介导的内吞作用和胆固醇转运。该联盟发现了血浆蛋白特征，可用于将急性住院COVID-19病例按疾病亚表型进行分层，其聚类成员关系可提供响应状态的信息，并与28天死亡率差异相关。

这种多组学血液图谱等研究将为COVID-19的未来药物开发、临床试验设计和个性化药物方法提供重要的见解。

Fischer教授看到了高通量蛋白质组学应用于临床环境的未来——仪器安装在医院，用于对患者样本进行日常筛查。因为质谱可以同时测量多种分析物，蛋白质组学可以从患者样本中分析整个途径或整个蛋白质组合，这可能会改善诊断。另一个好处是，大多数患者都有合并症，可以在基于系统生物学的方法中识别出MS。

然而，临床蛋白质组学面临着挑战，需要特殊的策略来应对从医院环境中的患者那里获得这类数据。此外，对于非多发性硬化症专家来说，诸如认证和易用性等后勤问题意味着这种可能性还需要几年的时间。Fischer教授解释道:

“在其他因素中，我们必须解决一些挑战，比如确保在不同地点分析相同的样本得到相同的结果。

但后来，我怀疑临床环境中的蛋白质组学可以用于开发更好的靶向药物，甚至是针对患者的或量身定制的治疗方案。”

自从与timsTOF Pro进行最初的试验以来，发现蛋白质组学设施的研究人员还继续扩大与Bruker在其他仪器和设备上的合作。Fischer教授解释了这种合作关系如何帮助该设施的其他项目:

“布鲁克在帮助我们进行脂质组学分析方面给予了我们极大的支持，我们刚刚开始这项研究。布鲁克有一群在该领域经验丰富的专家，他们很有帮助。

他们还协助我们将蛋白质组学与LMD结合起来的工作，现在想使用Bruker的timsTOF fleX补充MALDI成像。布鲁克也在研究全新的数据分析方法，目标是实时数据处理。

这些新进展对临床蛋白质组学研究的进展至关重要，我期待着看到我们的研究如何随着这些新的技术进步而继续发展。”

[1] Cox J和Mann M(2011)，定量，高分辨率蛋白质组学的数据驱动系统生物学，年。修订版生物化学，80:273-299。

凯士贤H，伯吉斯MW，斯佩希特H，华莱士L，克洛泽KR，吉列MA， &卡尔SA。(2017)，定量，多重工作流程的深入分析人类血浆和生物标志物发现质谱。自然学报，12(8)，1683-1701。

[3]安德森NL，安德森NG。(2002)，人类血浆蛋白质组:历史，特征，和诊断前景。Mol细胞蛋白质组学。11月,1(11):845 - 67。

[4] Meier F, Brunner AD, Koch S, Koch H, Lubeck M, Krause M, Goedecke N, Decker J, Kosinski T, Park M, Bache N, Hoerning O, Cox J, Räther O, Mann M.(2018)，在线并行积累-串行分段(PASEF)与新型捕获离子迁移质谱，Mol. Cell。蛋白质组学,https://doi.org/10.1074/mcp.TIR118.000900。

［5］Kosinski T, Heilig R, Bensaddek D, Bache N, Bjeld Hørning O, Fischer R, Koch H.，血浆蛋白质组学利用PASEF和4D特征比对高通量timsTOF Pro在11.5分钟内定量500个血浆蛋白质。

[6] Covid-19多组学血液图谱(COMBAT)联盟(2022)，Cell 185, 916-938, 2022。由Elsevier Inc.出版https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.01.012 ll

目标发现研究所(TDI)是由2019年诺贝尔奖获得者、FRS教授彼得·拉特克利夫爵士领导的一项重大的新合作研究计划。

路德维希癌症研究所牛津分校和药物发现中心(CMD)在新的NDM研究大楼建立了靶标发现研究所。TDI目前包括化学生物学、高通量、表型筛选、蛋白质组学和质谱和药物化学等几个小组。

布鲁克使科学家们能够取得突破性的发现，并开发提高人类生活质量的新应用。布鲁克的高性能科学仪器和高价值的分析和诊断解决方案使科学家能够在分子、细胞和微观层面探索生命和材料。雷竞技怎么下载雷竞技网页版

通过与客户的密切合作，Bruker在生命科学分子研究、应用和制药应用、显微镜和纳米分析、工业应用、细胞生物学、临床前成像、临床表型组学和蛋白质组学研究以及临床微生物学方面实现创新，提高生产力和客户成功。雷竞技怎么下载