timsTOF SCP

先进的离子光学和PASEF研究细胞异质性和生物学从单个细胞
质谱蛋白质组学已经成为理解生物功能和疾病机制的现代研究的主要内容。健康或病变的组织看似同质，其实是由含有各种不同蛋白质组的细胞组成的。破译每个单细胞中的蛋白质组的挑战——细胞异质性——是完全理解其功能的关键。
timsTOF SCP提供了一个从根本上改进的离子源概念。结合并行积累串行碎片(PASEF^®)获取方法，它提供了极高的速度和灵敏度来处理单细胞或少数细胞中形态或功能相似的翻译后修饰。

timsTOF SCP具有改进的离子源几何结构，包括1毫米毛细管识别，可将5倍高的离子转移到额外的高压级离子漏斗和8级差分抽真空系统。

更大的毛细管产生超高的灵敏度，额外的正交离子反射和后续漏斗提供了一个单独的、差分泵浦阶段，保持了timsTOF仪器系列预期的系统鲁棒性。

timsTOF SCP提供了离子传输到源的改进，同时通过增加高压真空级保持稳健性。这使得离子电流几乎提高了5倍。当与Evosep One Whisper方法结合使用时，在100 nL/min的流速下，直径可达到10nm /min

在PASEF方法中，Evosep One的灵敏度比之前的高流量结果提高了约100倍。这使得在真正的单细胞水平上实现无偏倚蛋白质组学，具有良好的重现性，稳健性和每个细胞约1500个蛋白质的覆盖首次。

阱离子迁移谱(TIMS)是一种最早的气相分离技术。除了高效液相色谱(HPLC)和质谱分析外，还通过增加分离维度解决了样品复杂性，增加了化合物表征的峰容量和置信度。

同样重要的是，TIMS装置还可以积累和浓缩给定质量和迁移率的离子，从而实现灵敏度和速度的独特提高。
双tims技术可以实现接近100%的占空比，促进前段离子的积累，而后段离子则根据其迁移率依次释放。这个过程的并行积累串行碎片(PASEF^®)可以进行碰撞截面(CCS)分析。

支持ccs的分析开辟了许多进一步的分析可能性，从更大的化合物识别确定性到自信的库匹配，以及在大型数据集中降低错误发现率(fdr)。

除了无偏倚的真正的单细胞蛋白质组学应用，timsTOF SCP还为涉及蛋白质组肽富集的工作流程提供了出色的灵敏度。免疫肽组学研究从血浆或组织中纯化免疫肽开始。

由于这些样本中免疫肽的丰度相对较低，timsTOF SCP是免疫肽组学发现新抗原的理想方法，在可用材料有限的情况下，如针穿刺活检。timsTOF SCP还具有革命性的磷酸蛋白组学用于癌症信号通路研究的敏感性。

使用捕获离子迁移谱(TIMS)分离肽离子，洗脱(~ 100 ms)，并在四极飞行时间(QTOF)中检测，生成TIMS ms热图。在PASEF中^®方法相同的TIMS分离使用与四极分离的特定离子物种在其洗脱和立即转移到下一个前驱体。母谱和片段谱按迁移率值对齐。

并行累积串行碎片(PASEF)^®)技术实现了> 100hz的测序速度。使用PASEF^®对低丰度多肽进行多次筛选，可提高其质谱质量。

PASEF^®:非常适合鸟枪蛋白质组学
由PASEF提供支持的timsTOF SCP^®提供>100 Hz的测序速度而不损失灵敏度或分辨率。这是通过使四极隔离质量窗口与来自TIMS漏斗的特定肽包的洗脱时间同步以及碰撞单元中的碰撞能量来实现的。

timsTOF SCP允许在超过100 Hz的测序速度和不受影响的蛋白质组深度下，以最小的样本负载(<200 ng)分析数百个样本。这改变了蛋白质组学的研究方式，但增加的数据需要一个新的数据分析水平。

数据分析是许多工作流中常见的瓶颈。现代分析方法的结果是由timsTOF SCP生成的数百行数据。Bruker引入了实时数据库搜索功能——实时并行数据库搜索引擎(PaSER)，它消除了这一障碍。使用PaSER，只要LC-MS运行完成，结果就可以得到——有效地运行&完成。

开放文件数据格式允许研究人员直接处理原始数据，并使用他们选择的行业领先软件。

MaxQuant软件适用于管理保留时间、离子迁移率、质量和信号强度等空间中的4维(4D)特征。这有利于肽、蛋白质和翻译后修饰的鉴定和定量，两者都来自PASEF^®和dia-PASEF^®数据。

PEAKS Studio将从头测序与传统的数据库搜索相结合，并针对处理timsTOF原始数据进行了优化。

读取timsTOF原始数据的高级蛋白质组学处理软件解决方案的数量正在稳步增长，包括Biognosys的Spectronaut和SpectroMine软件，以及Skyline、Genedata、Protein Metrics、Matrix Science、DIA-NN和MSFragger的Mascot Distiller软件。

支持ccs的可靠识别分析
timsControl允许自定义dia-PASEF窗口方案

我们感兴趣的离子。通过调整质量隔离宽度、TIMS范围和循环时间，可以使dia-PASEF适应不同的色谱方法。

将Evosep One系统的低流量液相色谱与Whisper结合，并结合dia-PASEF对timsTOF SCP的高灵敏度，从500 pg的细胞文摘中鉴定出2000多个蛋白质，从250 pg中鉴定出1500个蛋白质，证明了真正的单细胞蛋白质组学所需的灵敏度。从250 pg中鉴定出的蛋白质覆盖了大约4个数量级的丰度范围，可以在单细胞水平上进行定量蛋白质组分析。

了解TME及其浸润的免疫细胞可以被认为是影响疾病进展、治疗反应和患者生存的关键一步。由于其高灵敏度，timsTOF SCP能够在激光捕获显微解剖(LMD)从FFPE组织样本中切除的细胞上获得足够的蛋白质组深度。右图显示了一个典型的工作流程。

细胞标记物用于识别肿瘤块中的黑色素瘤癌细胞和与间质密切相关的细胞，随后在timsTOF SCP仪器上通过LMD和无偏4d -蛋白质组学分析分离这两个群体。

关键发现:富集分析揭示了中枢和外周黑色素瘤细胞之间的差异调节蛋白，具有潜在的疾病亚型，以指导临床决策。
结果由Matthias Mann教授提供(doi:https://doi.org/10.1101/2020.12.22.423933）