分析细胞结构和他们的组织理解函数在任何细胞类型是至关重要的。然而,可视化许多亚细胞结构是不可能与传统光学显微镜的光学衍射极限~ 200 - 300 nm。
单分子定位显微镜(SMLM)——高效、简单的过程,当执行先进的显微镜技术解决了这个问题,使研究人员探索新的细胞生物学前沿相关结构、组织、细胞功能互动,化学计量学。
许多有趣的细胞结构是小于光学衍射极限~ 200 - 300 nm。这些包括大部分细胞器和大分子的子结构机器,通道和受体。雷竞技怎么下载
询问和回答问题的分子组织,相互作用,这些和其他结构的化学计量学需要标记结构的成像分雷竞技怎么下载辨率低于光的衍射极限。
传统光学显微镜方法,如宽视野和共焦显微镜,可以形象和识别特别标记的细胞结构。然而,他们的能力是有限的图像光学衍射极限以下。另外,电子显微镜(EM)可以实现横向分辨率下降到0.1 - -0.2 nm,但特定的标签或定量测定细胞内的分子是非常具有挑战性的。
超分辨率显微术支持高分辨率imaging-down 20 nm外侧沿光轴和50 nm -专门标记细胞结构。它因此桥梁之间的差距传统光和电子显微镜(EM)技术。
*正确的:线粒体染色TOM20 Alexa 647,成像与SMLM (dSTORM)。
高分辨率(横向20 nm)搭配的能力形象特别标记结构使SMLM强国在细胞生物学研究的解决方案。发现由SMLM包括当地运动的可视化海拉细胞的染色质域内的8倍对称核孔复合体的非洲爪蟾蜍卵母细胞的径向对称九倍centriolar蛋白质CEP164,连接的管状结构和组织内的内质网(1、2]。
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感兴趣的决议需要可视化结构必须考虑当决定如果SMLM是正确的解决方案。衍射极限的大小结构的一些例子提供适合与SMLM成像。*的例子包括(但不限于):
*纳米子结构的例子及其维度是有用的生物数据的数据库。链接:https://bionumbers.hms.harvard.edu/search.aspx
具体地说,SMLM是最好的方法来研究细胞内特定纳米结构时,需要研究的问题:
SMLM已经被用于在细胞生物学回答以前未知的问题。SMLM多个特定结构是理想的成像在3 d和高分辨率,以及量化数据。参见下面的示例数据和描述,更多地了解研究的应用程序可以与SMLM独特的实现:
与上流社会的照明功能的力量Vutara VXL,整个视野照明均匀,导致整个地区的统一和可靠的数据采集。不仅SMLM获得统一的形象,但每个本地化数据点包含可用于定量分析的统计信息。使用这种技术,分子的绝对量化是可能的。相对量化也是可能的。
例如,缝隙连接蛋白、connexin43和电压门控钠离子通道,Nav1.5)都位于闰盘;然而,SMLM透露,Cx43和Nav1.5不是以数量和不平等的形式表达类似的数字集群(3]。
整个领域照明也很关键分析分子分布在一个样本。雷竞技怎么下载照亮了整个视野的能力,以及与每个本地化相关统计信息的采集,支持无偏和定量分析的分子在一个样本的分布。作为一个例子的分子分布分析,SML雷竞技怎么下载M允许对位atp酶的分布的可视化ParB DNA结合蛋白质局部细胞两极,协调染色体分离和细胞分裂1]。
SMLM解决的问题不能形象分子在200 nm。SMLM,可以形象~ 20 nm或少一项决议,支持精确成像的分子与在这个距离。例如SMLM,它被发现,尽管有密切联系connexin43 Nav1.5, connexin43集群的不到20%,只有10%的Nav1.5集群直接相互重叠,而他们重叠,这是最小的,这表明集群重叠无关地而不是代表一个完全与人口的两种蛋白质3]。
SMLM,细胞内的分子运动与高空间分辨率可以实时成像。单粒子跟踪的一个成功例子与SMLM表明,细菌细胞肌动蛋白同系物,MreB,运行在一个圆周模式在细菌细胞,由细胞壁合成(4]。
对:两个实验监测线粒体动力学,贴上(1)桔子HaloTag®染料(549)和(2)一个photactivatable红光对于染料(pa - jf - 646®)。
微管获得VXL——dSTORM固定微管的图片贴上Alexa 647使用主/ seconday抗体标记。
VXL收购——BSC1活细胞成像贴上Alexa 647转铁蛋白。
钠离子通道和N-cadherin分子的点云表示
图片由:
Rengasayee Veeraraghavan、博士和希瑟·l·Struckman狗屁美国俄亥俄州立大学硕士Nanocardiology实验室
力量的Vutara VXL提供一流的易用性和成像深度。关键特性支持细胞生物学研究人员的需求包括:
力量的Vutara VXL非常适合细胞生物学需要(1)高分辨率的研究需求,(2)三维可视化和/或(3)molecule-specific目标和适用于样本从单细胞到50微米厚的组织样本。
工作流和使用Vutara VXL,微流体,SRX软件精简和力量的科学家可以提供个性化的支持数据分析样品制备Vutara VXL用户。
SMLM通过本地化单身,来实现超分辨率闪烁的染料分子与精度高。衍射极限光学显微镜不能区分两个染料分子在距离不到300,因为他们的点扩散函数重叠太多。在SMLM,只有两个染料分子中的一个是活跃的,而另一个是黑暗。现在,我们可以确定这个分子的位置精度高。一段时间后,活性染料是呈现黑色,前面黑染料变得活跃。现在我们可以确定第二个分子的位置精度高。染料可以发生积极的开关切换(例如,photo-activatable荧光蛋白在棕榈)或自发dSTORM(例如,Alexa萤石647)。
广泛的样本类型可以与SMLM成像。固定和活样本可以用SMLM成像,尽管固定样本成像更常见。与Vutara VXL,可以形象不同的样本类型,从细胞培养和组织切片,整个生物体,比如果蝇幼虫和秀丽隐杆线虫,水凝胶可达100微米厚。
的两栖飞机技术Vutara VXL,可以想象到100微米的盖玻片在水凝胶中,和50微米厚的样品,如组织切片或甚至整个生物体。组织清算可能需要厚的组织或整个生物样本的最优成像。
尽管SMLM是一个新的和先进的成像方法,样品准备和成像协议理解和记录。力量应用专家可以帮助用户选择适当的标记策略和成像设置。
虽然比固定样本成像不太常见,生动的示例与SMLM成像可以执行。把这个研讨会讨论成像活样品的准备。有关更多信息,请参见“参考资料和资源”live-cell成像技术和最佳实践(3、4]。